Autor: dr Anita Skakić, molekularni biolog


Sada kada već duže vreme živimo u pandemiji COVID-19 i na svakom koraku se susrećemo sa raznim informacijama, postalo je jasno koji su to koraci koje moramo preduzeti za efikasno suzbijanje epidemije: savesne mere prevencije poput nošenja maski, pranja ruku i socijalnog distanciranja, zatim široko rasprostranjeno testiranje na COVID-19 osoba sa razvijenim simptomima infekcije kao i njihovih kontakata kako bismo pomogli u zaustavljanju širenja virusa. U kombinaciji, ovo su naše najbolje mere predostrožnosti dok se očekuju bolji tretmani i široko rasprostranjena vakcinacija. Međutim, susretali smo se mnogo puta sa pitanjem, koji test je validan i u kojim danima infekcije? Odgovor je sumiran na slici ispod.

Procenjeno variranje detekcije prisustva virusa SARS-CoV-2 upotrebom različitih testova u odnosu na pojavu prvih simptoma bolesti.

Detekcija virusa metodom PCR povećava se nakon pojave prvih simptoma, dostižući svoj vrhunac u prvoj nedelji nakon pojave simptoma, a zatim se kontinuirano smanjuje. IgM i IgG antitela na SARS-CoV-2 pojavljuju se u serumu ili plazmi zaraženih osoba od nekoliko dana do 2 nedelje nakon ovih simptoma i dok nivoi IgM opadaju nakon završetka infekcije, nivoi IgG ostaju visoki i stoga uočljivi duži vremenski period.

Postoje testovi koji dijagnostikuju trenutnu infekciju i testovi koji pokazuju da li ste ranije imali SARS-CoV-2, virus koji uzrokuje COVID-19. Testovi se razlikuju u pogledu tačnosti i senzitivnosti detekcije na prisustvo virusa u organizmu, količine novca koje je potrebno odvojiti i vremena dobijanja rezultata.

Trenutno u Srbiji postoje tri metode za testiranje na COVID-19:

  1. Brzi antigenski test – Odgovarajući uzorak za ovu analizu je bris iz nazofarinksa (nosnog dela ždrela). Nakon uzorkovanja, rezultat se dobija posle 10 – 30 minuta. Ovaj test je jednostavniji i brži za izvođenje od drugih metoda, ali je manje osetljiv od PCR testa. Pokazano je da se upotrebom ovog testa najprecizniji rezultati dobijaju kod pacijenata sa visokim virusnim opterećenjem, što obično postoji 3 dana pre pojave prvih simptoma bolesti, kao i u toku prvih 1-5 dana oboljenja.

Šta je sa tačnošću?

Lažno negativni rezultati se češće javljaju kod antigenskih testova nego kod molekularnih testova. Negativan rezultat testa na antigen SARS-CoV-2 ne može u potpunosti isključiti aktivnu infekciju COVID-19, pa bi zato trebalo ponoviti testiranje ili, ako je to moguće, uraditi PCR test, posebno kod pacijenata sa razvijenim simptomima virusne infekcije. Budući da je testiranje antigena brže, jeftinije i za sprovođenje zahteva manje složenu tehnologiju od molekularnog testa, stručnjaci preporučuju ponovljeno testiranje antigena kao razumnu strategiju. Stopa lažno pozitivnih rezultata ispitivanja antigena je blizu nule.

  • PCR test (molekularni test, test virusne RNK ili test nukleinske kiseline) je glavni javno dostupan test u Srbiji, jer je ovaj test najpouzdaniji za dijagnozu COVID-19. Predstavlja zlatni standard u testiranju prisustva virusa SARS-CoV-2 u organizmu čoveka. Test se vrši uzimanjem brisa, najčešće iz nosa i/ili grla (nazofaringealni bris). Najbolje vreme za testiranje osobe koja je potencijalno zaražena ovim virusom je tokom prve nedelje bolesti. To je zato što je tada prisutna najveća količina virusa u telu.

Šta detektuje ovaj test?

PCR testom detektuje se prisustvo genetičkog materijala (RNK virusa) koji potiče samo i isključivo od virusa SARS-CoV-2. Prisustvo gena drugih virusa, pa čak i drugih veoma srodnih korona virusa (kao što su oni koji izazivaju običnu prehladu) se ovom metodom ne mogu detektovati. Zbog toga se kaže da je ovaj test gotovo 100% specifičan (jer se ne detektuju drugi virusi osim testiranog), kao i da je veoma senzitivan (jer se detektuje prisustvo od svega stotinak virusa u uzorku). Koliko vremena je potrebno za dobijanje rezultata zavisi od kapaciteta laboratorije. Rezultati mogu biti spremni za nekoliko sati, ali često je potrebno najmanje dan ili dva.

Šta je sa tačnošću PCR testa?

Svi smo se do sad susreli sa informacijama da postoje ljudi kod kojih klinička slika jasno upućuje na prisustvo infekcije virusom SARS-CoV-2, a rezultat PCR testa je bio negativan. Kako je to moguće? Postoji više razloga za takav rezultat:

  • uzorkovanje nije dobro izvršeno: prilikom uzimanja brisa iz nosnog dela ždrela ili grla nije dodirnut onaj deo sluznice ždrela na kome se virusi nalazio,
  • nepažljivo čuvanje uzoraka može uticati na tačnost rezultata, ili
  • virus se više ne nalazi u ždrelu, već se „spustio“ u pluća ili digestivni trakt. Zbog toga je moguće da se virus, inače prisutan u organizmu, ne detektuje ovim testom. Zato je veoma važno uzeti u obzir sve kliničke simptome, biohemijske parametre krvi i snimak pluća, bez obzira na prisustvo negativnog testa.

Stopa lažno negativnih rezultata (koliko često je rezultat testa negativan iako je virus prisutan) varira u zavisnosti od toga koliko dugo je infekcija prisutna u organizmu: u jednoj studiji (Kucirka i saradnici, 2020) stopa lažno negativnih rezultata iznosila je 20% kada je uzorkovanje vršeno pet dana nakon pojave simptoma, ali mnogo je veća ako je uzorkovanje vršeno u prvim danima infekcije (1.-3. dana). Zbog toga se kaže da je njegova klinička senzitivnost između 70-98% (u zavisnosti od grupe pacijenata kod kojih je senzitivnost testa procenjivana, tj. od faze infekcije). Stopa lažno pozitivnih rezultata (koliko često test kaže da imate virus, a zapravo ga nemate) trebalo bi da bude ravna nuli. Smatra se da je većina lažno pozitivnih rezultata posledica kontaminacije u laboratoriji ili drugih problema sa načinom na koji je laboratorija izvršila test, a ne zbog ograničenja samog testa. Molekularni test koji koristi bris nosa obično je najbolja opcija, jer će rezultirati manjim brojem lažno negativnih rezultata od ostalih dijagnostičkih testova.

  • Serološki testovi – ovim metodama detektuje se prisustvo određenih klasa imunoglobulina (IgM, IgA i IgG) u krvi (tj. serumu) pacijenata, koja se proizvode u organizmu kao odgovor na prisustvo virusa.

IgM antitela, koja su pokazatelj rane virusne infekcije, javljaju se neposredno pre, za vreme, ili posle pojave prvih simptoma bolesti, u zavisnosti od vremena trajanja inkubacije. Prosečno vreme inkubacije (vreme koje protekne od kontakta sa izvorom infekcije SARS-CoV-2 do pojave prvih simptoma) je 4-7 dana, a može biti od 3 do 14 dana. IgM antitela svoj najviši nivo u serumu postižu nedelju dana nakon pojave prvih simptoma bolesti, a zatim opadaju, tako da se u trećoj nedelji od početka bolesti, uglavnom, ne mogu naći u serumu.

IgA antitela su lokalna antitela koja se u ranoj infekciji koncentrišu na površini sluzokože grla, nosa, creva i u sekretima. Javljaju se nekoliko dana posle pojave simptoma i svoj maksimum dostižu dve nedelje posle početka bolesti, a zatim opadaju i nestaju oko 4 nedelje nakon pojave simptoma.

IgG antitela počinju da se stvaraju u drugoj nedelji bolesti i svoj najviši nivo dostižu oko 4 nedelje od pojave simptoma. Obično kod osoba koje su imale težu kliničku sliku, razvijaju se viši nivoi IgG antitela. Ova antitela se duže vreme zadržavaju u organizmu i pokazatelj su preležane infekcije. Blagi i asimptomatski slučajevi pokazuju odloženo stvaranje i nisku koncentraciju sve tri klase antitela, tako da postoji mogućnost da osobe koje su preležale COVID-19 uopšte nemaju značajan nivo IgG antitela na SARS-CoV-2.

Postoje tri vrste ovih testova:

1) Imunohromatografski (brzi) testovi – najmanje osetljivi, ali su najjeftiniji i za njihovo izvođenje nije potrebno više od pola sata. Zasnivaju se na promeni boje test trake na koju se nanese kap seruma pacijenta, kod koga postoji povišena koncentracija određene vrste antitela koja se ispituju. Ovo je kvalitativna metoda, tj. rezultat je pozitivan ili negativan, bez mogućnosti merenja vrednosti koncentracije antitela.

2) ELISA – klasični serološki testovi koji se zasnivaju na merenju jačine obojenosti rastvora u kome dolazi do reakcije između antitela prisutnih u serumu pacijenta i čestica obeleženih bojom koje se vezuju za ta antitela. Ovo je kvantitativna metoda, tj. rezultat je pozitivan ili negativan, uz mogućnost merenja vrednosti koncentracije antitela. Rezultati ovog testa najčešće se dobijaju istog dana ili u roku od 48 h.

3) imunofluorescentni testovi – zasnivaju na vezivanju antitela prisutnih u serumu pacijenta sa česticama obeleženim fluorescentnom bojom, što se uočava pregledom mikroskopskog preparata pomoću fluorescentnog mikroskopa. Ovo je kvalitativna, ali daleko osetljivija metoda u odnosu na brze testove, tj. rezultat može biti pozitivan ili negativan, bez mogućnosti merenja vrednosti koncentracije antitela. Rezultati su obično dostupni u roku od jednog dana.

Šta je sa tačnošću?

Prerano testiranje na antitela može dovesti do lažno negativnih rezultata. To je zato što je potrebno nedelju ili dve nakon infekcije da vaš imuni sistem proizvede antitela. Prijavljena stopa lažnih negativa je 20%. Međutim, opseg lažnih negativa je od 0% do 30%, u zavisnosti od studije i kada se u toku infekcije vrši test. Istraživanja sugerišu da nivo antitela može da opadne za samo nekoliko meseci. I dok pozitivan test antitela dokazuje da ste bili izloženi virusu, još uvek nije poznato da li takvi rezultati ukazuju na nedostatak zaraznosti ili dugotrajan, zaštitni imunitet.

Ako bismo imali brzo, precizno i jeftino kućno testiranje, mogli bismo se više puta testirati pre nego što odemo na posao, krenemo u školu ili provedemo vreme u blizini drugih. Iako imamo sreću da smo imali dovoljno precizne testove na raspolaganju tako rano tokom identifikovanja novog virusa, potrebni su bolji testovi i lakši pristup njima. I na kraju, široko dostupni testovi i kratko vreme za dobijanje rezultata su neophodni za efikasno stavljanje ovog virusa pod kontrolu dok čekamo vakcinaciju većine stanovništva.

Literatura:

[1] Kucirka LM, Lauer SA, Laeyendecker O, Boon D, Lessler J. Variation in False-Negative Rate of Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction-Based SARS-CoV-2 Tests by Time Since Exposure. Ann Intern Med. 2020;173(4):262-267. doi:10.7326/M20-1495

[2] Rapid Decay of Anti-SARS-CoV-2 Antibodies in Persons with Mild Covid-19. N Engl J Med. 2020;383(11):e74. doi:10.1056/NEJMx200017

[3] Sethuraman N, Jeremiah SS, Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020;323(22):2249–2251. doi:10.1001/jama.2020.8259

[4] World Health Organization – Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays, Interim guidance, 11 September 2020